پراکسی زومها، اندامک های یوکاریوتی تک غشایی دارای عملکردهای متنوع بسته به بافت، مرحله رشد و شرایط محیطی می باشند. پروتئین های ماتریکس پراکسی زوم در سیتوپلاسم ساخته و توسط سیگنال هدف یابی پراکسی زومی (PTS) به درون این اندامک هدایت می شوند. یکی از پروتئین های ماتریکس پراکسی زوم، پروتئین پراکسی زومی (PEP) می باشد که عملکرد آن ناشناخته است. به منظور بررسی این ژن،PEP-cDNA  کلون شده در وکتور pEGFP-C1، وارد وکتور بیانی پروکاریوتی pGEX-6p-2 گردید تا در آینده بتوان PEP نشاندار شده با GST را جهت خالص سازی پروتئین و بررسی بیوشیمیایی بیشتر این پروتئین تولید نمود. ژن PEP همچنین در پایین دست ژن FLAG قرار گرفت و DNA نوترکیب FLAG-PEP در وکتور بیانی یوکاریوتی pUcD2SRaMCSHyg وارد گردید تا در آینده برای بیان گذرا و شناسایی جایگاه پروتئین PEP، از این پروتئین نشاندار استفاده شود. نتایج بدست آمده نشان دادند که قطعه PEP-DNA و FLAG-PEP به درستی و بدون هیچگونه موتاسیونی درون وکتورها قرار گرفته اند.

پراکسی زوم ها یکی از اندامک های سلول های یوکاریوتی هستند که دارای وظایف گوناگونی می باشند. یکی از پروتئین های ماتریکس پراکسی زوم به نام پروتئین پراکسی زومی (PEP) نامیده می شود که در سال 2002 کلون گردید. PEP واجد 209 اسید آمینه است و به نظر می رسد که در تمایز بافت های جنین موش نقش دارد. از جمله خصوصیات این پروتئین، افزایش بیان طی میوژنز و تمایز مغز جنین موش می باشد. برای تحقیق برروی نحوه عملکرد این پروتئین بر مکانیسم نوروژنز نیاز بود که بتوان در مراحل مختلف نوروژنز، این ژن را خاموش یا روشن کرد و نتایج حاصل از تغییر در بیان آن را بررسی نمود. لذا در مطالعه حاضر PEP cDNA را در سیستم بیانی یوکاریوتی سامانه القایی Tet off وارد نمودیم تا بتوان در آینده آن را به رده سلولی بنیادی ترانسفکت نماییم و بیان بیش از حد آن را توسط داکسی سیکلین یا تتراسیکلین با تنظیم سطح آنتی بیوتیک در سلول های بنیادی موشی بررسی نماییم. برای این منظور نیاز بود که cDNA هدف تکثیر شود و سپس به داخل حامل الحاق گردد. بنابراین در طراحی پرایمر وجود دو محل برش آنزیم محدودالاثر در ابتدا و انتهای ژن همساز با حامل و همچنین توالی Kozak جهت بیان بیشتر پروتنین PEP درنظر گرفته شد و PEP cDNA تکثیر گردید. با تاثیر آنزیم های محدودالاثر در دو انتهای PEP cDNA نهایتا قطعه برش یافته به داخل حامل pTRE2pur از سیستم بیانی Tet off وارد شد. سیستم بیانی Tet off یک سیستم بیانی دوگانه می باشد، به این معنی که واجد یک وکتور به نام Tet off است که یک عنصر پروتئینی را تولید کرده که به واسطه آنتی بیوتیک تتراسیکلین یا داکسی سیکلین بیان ژن را در وکتور دوم به نام pTRE2pur، روشن و خاموش می کند. در این سیستم ابتدا باید وکتور Tet off را به سلول هدف ترانسفکت کرده و دودمان سلول پایدار ایجاد نمود و سپس وکتور دوم (pTRE2pur) که حامل ژن است را به این دودمان وارد نمود. برای اینکه به طور یقین پایدار بودن سلول به حامل Tet off را به اثبات برسانیم، علاوه بر ساخت ,TRE2pur/PEP cDNA EGFP را بداخل حامل TRE2pur وارد نموده و سازه TRE2pur/EGFP را تهیه نمودیم.

التهاب پاسخ طبیعی بدن به آسیب است، که منجر به حذف بقایای سلول های مرده و عفونت ها از محل آسیب و ترمیم بافت می شود.با این حال التهاب طولانی مدت به علت ایجاد حلقه های بازخوردی مثبت و تخریب سلول های سالم مضر است. از این رو استفاده از مکانیسم های تنظیمی برای تعدیل التهاب ضروری است. گیرنده های فعال کننده تکثیر پراکسی زومی، فاکتورهای رونویسی فعال شونده توسط لیگاند و اعضایی از ابرخانواده گیرنده هسته ای هستند. از بین این اعضا، ایزوفرم گامای این گیرنده در تنظیم فرآیندهای سلولی متعددی مثل التهاب درگیر است. مشخص شده است که چندین فعال کننده ایزوفرم گامای این نوع گیرنده ها از طریق فعال سازی ژن های مهارکننده التهاب، مهارسازی ژن های التهابی و برهمکنش با سایر گیرنده ها به منظور مهار عوامل التهابی در عملکرد ایمنی نقش دارند. هدف از این مقاله مروری تشریح وقایع مولکولی است که توسط این گیرنده ها در فرایند پیچبده التهاب صورت می گیرد.

گیرنده فعال کننده پراکسی زومی نوع g1 موشی عملکردهای گستردهای در درون سلول دارد که می توان به تنظیم رشد و نمو سلولی، تنظیم پاسخ های ایمنی و تعادل انرژی و تنظیم مکانیسم تمایز سلولی در سلولهای بنیادی اشاره نمود. هدف از پژوهش حاضر، کلون نمودن cDNA گیرنده فعال کننده پراکسی زومی نوع g1 موشی در وکتور بیانی EGFP-C1 میباشد تا بتوان در مطالعات بعدی با انتقال آن به درون سلولهای بنیادی مکانیسم و روند تمایز سلولی را مورد مطالعه قرار دهیم. پس از استخراج RNA کل سلول از بافت چربی موش بالغ،cDNA  مربوطه تهیه شد و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر PPARg1 cDNA صورت گرفت. PEP cDNA تکثیر شده پس از هضم آنزیمی در پلاسمید EGFP-C1 قرار گرفت. باکتری های One Shot TOP 10 با محصول اتصال پلاسمید وcDNA PPARg1  ترانسفورم گردیدند و پس از کشت کلونی های مثبت حاوی پلاسمید نوترکیب با آزمون PCR انتخاب و تکثیر گردیدند پس از تایید بوسیله تست های هضم آنزیمی، تعیین توالی انجام شد. نتایج هضم آنزیمی و تعیین توالی ثابت کرد که قطعه تکثیر و کلون شده همان PPARg1 cDNA می باشد. cDNA این ژن شامل 1428 جفت باز می باشد.

پس از گذر از تحقیقات ژنومی و وجود انبوهی از اطلاعات در بانک های ژنومی اینک دوران تحقیقات در زمینه پساژنومی و شناخت محصولات ژنها، چگونگی ارتباطات آنها با یکدیگر و شناخت مسیرهای داخل سلولی با ابزار توانمند پروتئومیکس است. هدف از این بررسی بهینه سازی شرایط لازم جهت تولید پروتئین نوترکیب پراکسیزومی موشی (PEP) در سویه مناسب و مستعد شده از اشرشیاکلی به نام BL21 میباشد. پروتئین نوترکیب PEP در مراحل بعد خالص شده و به عنوان بخشی از مطالعات پروتئومیکسی برای شناسایی اجزاء سلولی واکنش دهنده با آن به کار خواهد رفت.در این بررسی وکتور بیانی پروکاریوتی (pGEX6P2) که در آن cDNA PEP در مجاورت توالی کدکننده GST (گلوتاتیون ترانسفراز) قرار داده شده است، استفاده شد. سلول های باکتریایی سویه BL21 بوسیله این وکتور بیانی ترانسفورم شدند. برای به دست آوردن بالاترین میزان بیان و حلالیت پروتئین، کشت سلولهای باکتریایی در محدوده دمایی 37-20 سانتی گراد ارزیابی شد. همچنین غلظت مناسب IPTG برای القاء بیان با بررسی محدوده 0.1 تا 10 میلی مولار صورت گرفت. پس از به دست آوردن بالاترین میزان بیان در گام بعدی لازم است پروتئین های درون سلولی آزاد شوند، بنابراین با استفاده از امواج اولتراسوند با قدرت ها و در زمان های متفاوت سلول ها لیز و سپس با افزودن شوینده NP40 یا Triton X-100 در غلظت های مختلف، پروتئین های محلول باکتریایی و پروتئین نوترکیب بیان شده، آزاد شدند.بهینه ترین حالت برای بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب PEP در دمای 20oC و غلظت  0.1 mg/mlاز IPTG به دست آمد. همچنین تفاوتی در بکارگیری TritonX100 یا NP40 به عنوان شوینده های حلال غشایی به دست نیامد. هر چند که بهترین غلظت برای شوینده 1% (حجمی/حجمی) مشخص شد.

گیرنده های فعال شده با تکثیرکنندة پراکسی زوم (PPARs: Peroxisome proliferator-activated receptors)، به ابرخانوادة گیرندة هسته ای هورمون تعلق دارند و پس از اتصال لیگاند طبیعی یا مصنوعی و تشکیل هترودایمر با گیرنده های رتینوئیک X (RXR: Retinoic X receptors)، به عنوان فاکتورهای رونویسی عمل می کنند. آنها رونویسی از ژن ها را آغاز می کنند تا متابولیسم لیپید و کربوهیدرات را با وضعیت تکثیر و تمایز سلول هماهنگ کنند. اسیدهای چرب و مشتقات آنها، لیگاندهای طبیعی هستند. تاکنون سه نوع PPAR شناسایی شده است: PPARα، PPARγ و PPARβ/δ. برای هریک از این سه زیرگروه، آگونیست و آنتاگونیست های دارویی تولید شده است. علاوه براین، آگونیست های همگانی(Panagonists) نیز برای هدف قراردادن ترکیبی این زیرگروه ها طراحی شده اند تا عوارض جانبی داروها کاهش یابد. PPARs، هومئوستاز انرژی در سلول ها کنترل می کنند. به علاوه، در سلول های ایمنی نیز بیان می شوند و نقش مهمی در تمایز و سرنوشت آنها دارند. با توجه به تأثیر فعالیت PPARs بر عملکرد سلول های ایمنی ذاتی و تطبیقی و همچنین، نقش آنها در بیماری های مرتبط با سیستم ایمنی، می توان با هدف قراردادن این فاکتورهای رونویسی، برخی از بیماری ها را نظیر سندرم آنتی فسفولیپید، التهاب کبد، میوکاردیت، بیماری های تخریب کنندة سیستم عصبی، پسوریازیس، آسم، بیماری التهابی روده، التهاب کلیه، اترواسکلروز درمان کرد. علاوه براین، به دلیل اهمیت نقش PPARها در تنظیم متابولیسم بافت ها، چند مورد از آن ها مورد بررسی قرار گرفتند.

یکی از روشها برای بیان پروتئین ها، نشاندار کردن آنها توسط توالیهای نشانه پپتیدی است که طی آن پپتید نشانه به کمک تکنولوژی DNA نوترکیب به پروتئین مورد نظر متصل می شود و سپس با استفاده از آنتی بادی اختصاصی علیه پپتید نشانه ردیابی می گردد. هدف از این مطالعه ساب کلون کردن cDNA ژن پروتئین پراکسیزومی (PEP) در یک وکتور بیانی یوکاریوتی بود که به موجب آن قطعه کایمر PEP-cDNA متصل به پپتید نشانه FLAG تولید گردید. قطعه نوترکیب FLAG-PEP با استفاده از روش Splicing by overlap extension polymerase chain reaction (SOE PCR) ساخته شد و سپس وارد وکتور بیانی یوکاریوتی pUcD2SRaMCSHyg گردید. به منظور بررسی جایگاه درون سلولی پروتئین PEP متصل به پپتید FLAG، بیان گذاری پلاسمید ساخته شده در سلولهای CHO انجام شد که طی آن سلولهای ترانسفکت شده توسط پلاسمید نوترکیب نشان دادند که پروتئین FLAG-PEP از الگویی مشابه با کاتالاز که آنزیم اختصاصی پراکسیزوم است پیروی می کند.